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活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的核心是通過(guò)對(duì)活細(xì)胞中的部分細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行微創(chuàng)提取，并對(duì)極其微量的細(xì)胞質(zhì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)在進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，依舊保持細(xì)胞的存活和功能，從而可以跟蹤細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。

細(xì)胞是生命的基本單位，了解它的過(guò)去、現(xiàn)在和未來(lái)不僅有助于我們了解正常的發(fā)育過(guò)程，也對(duì)理解疾病的產(chǎn)生和發(fā)展至關(guān)重要。然而，想要看清細(xì)胞的“前世今生”仍然面臨很大的技術(shù)困難。

(資料圖片僅供參考)

8月17日，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所研究員陳萬(wàn)澤以共同第一作者身份在國(guó)際頂級(jí)期刊《自然》雜志上發(fā)表長(zhǎng)文，介紹了他們研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際首創(chuàng)的活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（Live-seq），該技術(shù)首次讓單細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄測(cè)序后，依然能保持細(xì)胞存活，首次實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞全基因表達(dá)的連續(xù)觀(guān)測(cè)。

“該研究實(shí)現(xiàn)了使用活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)同一個(gè)活細(xì)胞多次分離部分細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行多次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，表明這一技術(shù)有望在將來(lái)用于構(gòu)建單個(gè)活細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組系列變化動(dòng)態(tài)模型。該研究為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序提供了全新的研究策略，為我們理解生命過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化提供了強(qiáng)有力的手段，是這一領(lǐng)域的又一重大突破。” 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授湯富酬評(píng)論道。

不殺死細(xì)胞就能進(jìn)行測(cè)序

為什么人類(lèi)體內(nèi)的細(xì)胞擁有的基因組幾乎一樣，但是每個(gè)人卻各不相同呢？基因組中數(shù)萬(wàn)個(gè)基因表達(dá)與否和表達(dá)程度高低，很大程度上決定了細(xì)胞的種類(lèi)和功能。

因此，如果知道細(xì)胞不同時(shí)間的基因表達(dá)的變化，就能夠了解細(xì)胞的過(guò)去、現(xiàn)在和未來(lái)。

當(dāng)前，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是了解細(xì)胞狀態(tài)的重要手段，通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠看清細(xì)胞現(xiàn)在所有基因的表達(dá)狀態(tài)。但是該技術(shù)在理解細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化方面卻面臨很大挑戰(zhàn)。

“利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)來(lái)觀(guān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)的前提，是需要將細(xì)胞裂解，提取其中的RNA來(lái)測(cè)定每個(gè)基因表達(dá)量的高低，但這樣就不可避免地殺死了細(xì)胞。”陳萬(wàn)澤說(shuō)道，“使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，也只能了解到一個(gè)細(xì)胞當(dāng)下的狀態(tài)，卻不能了解它的過(guò)去，也無(wú)法知曉它將來(lái)的功能。”

通過(guò)近7年的努力，陳萬(wàn)澤與合作者開(kāi)發(fā)了活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，其核心是通過(guò)對(duì)活細(xì)胞中的部分細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行微創(chuàng)提取，并對(duì)極其微量的細(xì)胞質(zhì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)在進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，依舊保持細(xì)胞的存活和功能，從而可以跟蹤細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。

論文通訊作者、瑞士洛桑聯(lián)邦理工學(xué)院教授巴特·普朗克（Bart Deplancke）表示，該技術(shù)兼具全基因表達(dá)分辨率和動(dòng)態(tài)解析能力，是目前對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組直接動(dòng)態(tài)測(cè)量、偶聯(lián)細(xì)胞現(xiàn)有狀態(tài)和其后續(xù)表型的唯一解決方案。

歷經(jīng)兩次碰壁終于“吸”出RNA

如何在不殺死細(xì)胞的前提下，看到細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化？

“我們首先想到的是外泌體，它是細(xì)胞向外面吐出來(lái)的小泡，里面有蛋白質(zhì)、RNA等物質(zhì)。如果我們把單個(gè)細(xì)胞的外泌體都收集起來(lái)，再對(duì)其中的RNA進(jìn)行測(cè)量，或許就可以在一定程度上反映細(xì)胞狀態(tài)而又不殺死細(xì)胞。”陳萬(wàn)澤說(shuō)道。

單個(gè)細(xì)胞中僅有10皮克的RNA，這相當(dāng)于一克的一千億分之一的重量，而細(xì)胞分泌的外泌體中的RNA更是少之又少。研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種微流控技術(shù)用以完成單細(xì)胞捕獲、外泌體收集等，但他們發(fā)現(xiàn)由于外泌體中的RNA數(shù)量太少，根本無(wú)法實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分子水平的觀(guān)測(cè)。

隨后，陳萬(wàn)澤嘗試?yán)迷谏茖W(xué)領(lǐng)域非常小眾的原子力顯微鏡來(lái)獲取細(xì)胞中的RNA。它有一個(gè)很尖的硅探針，多用來(lái)檢測(cè)物質(zhì)表面性質(zhì)。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)探針進(jìn)行表面活化、修飾、洗脫等改造，讓其能夠把細(xì)胞中的RNA“釣”出來(lái)。

“這種探針很細(xì)，對(duì)細(xì)胞的損傷很小，就像魚(yú)鉤一樣，改造后可以把細(xì)胞中的RNA‘釣’出來(lái)，并能保證細(xì)胞繼續(xù)存活。我們改造了數(shù)十個(gè)探針后，結(jié)果只在兩個(gè)細(xì)胞上成功‘釣’到了RNA。”陳萬(wàn)澤回憶道，當(dāng)時(shí)購(gòu)買(mǎi)一個(gè)原子力顯微鏡探針需要800美元，研究成本太高，成功率太低，這種情況讓這項(xiàng)研究再次面臨阻礙。

在一次偶然的學(xué)術(shù)交流中，陳萬(wàn)澤與導(dǎo)師了解到，瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的朱麗亞·沃爾特（Julia Vorholt）實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)了一種特殊的原子力顯微鏡，能夠吸出一部分細(xì)胞質(zhì)。

一番交流后，陳萬(wàn)澤團(tuán)隊(duì)與朱麗亞·沃爾特實(shí)驗(yàn)室一拍即合，展開(kāi)了聯(lián)合攻關(guān)。聯(lián)合團(tuán)隊(duì)對(duì)一系列的實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，解決了RNA降解、低溫下的快速操作、超微量樣品轉(zhuǎn)移、采樣通道清洗避免交叉污染、圖像下追蹤細(xì)胞等多個(gè)問(wèn)題，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

聯(lián)合團(tuán)隊(duì)利用重新改造后的活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，對(duì)5種類(lèi)型共295個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)能夠有效區(qū)分不同類(lèi)型的細(xì)胞，且平均每個(gè)細(xì)胞能檢測(cè)到約4112個(gè)基因的表達(dá)信息。

僅對(duì)少量的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行測(cè)序，是否就能代表細(xì)胞的狀態(tài)？

“我們平行比較了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與普通的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果高度吻合，證明活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能夠很好地體現(xiàn)細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)。”陳萬(wàn)澤說(shuō)道。

細(xì)胞的存活率又如何保證呢？

“這種特殊的原子力顯微鏡探針尖端只有幾百個(gè)納米大小，對(duì)細(xì)胞損傷極小。吸取約5%—50%的細(xì)胞質(zhì)后，細(xì)胞體積可以快速恢復(fù)到正常水平，存活率為85%—89%，細(xì)胞能進(jìn)行正常分裂。通過(guò)一系列的功能分析和分子表征，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)細(xì)胞的狀態(tài)有顯著的影響。”陳萬(wàn)澤表示。

對(duì)此，審稿人在評(píng)審意見(jiàn)中也寫(xiě)道：“由于細(xì)胞測(cè)序后仍舊存活，活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)同一個(gè)細(xì)胞全基因表達(dá)的連續(xù)測(cè)量。”

細(xì)胞測(cè)序結(jié)果從“高清圖片”到“高清電影”

在細(xì)胞觀(guān)測(cè)技術(shù)史上，顯微成像和基因編輯介導(dǎo)的分子記錄等技術(shù)不僅能觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、死亡等過(guò)程，還能觀(guān)測(cè)細(xì)胞中的單個(gè)或幾個(gè)基因指標(biāo)。

2009年，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)為更系統(tǒng)全面地定義細(xì)胞類(lèi)型和狀態(tài)提供了變革性手段。但人們?nèi)匀恢荒苡^(guān)察到細(xì)胞的靜態(tài)狀態(tài)，無(wú)法連續(xù)觀(guān)測(cè)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)或者檢查細(xì)胞后續(xù)的表型。

如果將利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)觀(guān)測(cè)細(xì)胞，比喻為看一張細(xì)胞在分子水平的高清圖片，那么利用活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)觀(guān)測(cè)細(xì)胞，就好比看一部細(xì)胞的高清電影，能夠看見(jiàn)它的“前世今生”。

“活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以回答細(xì)胞怎樣的過(guò)去決定了它的現(xiàn)在，不僅知道細(xì)胞為何存在差異，還知道這些差異從何而來(lái)。”陳萬(wàn)澤介紹。

在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)利用活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)直接測(cè)定了同一個(gè)巨噬細(xì)胞在不同時(shí)間的狀態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞起始狀態(tài)的少數(shù)基因的表達(dá)差異和噪音（如Nfkbia、Gsn等）是決定細(xì)胞后續(xù)反應(yīng)差異的重要原因。然而，普通的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)無(wú)法找到這些規(guī)律。

陳萬(wàn)澤表示，盡管活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)仍然存在諸多挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步完善，比如低通量、暫不能在體內(nèi)應(yīng)用、在高度極化且mRNA分布不均的細(xì)胞中無(wú)法實(shí)現(xiàn)全細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、對(duì)細(xì)胞更多次的采樣還需進(jìn)一步研究等，但該技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞連續(xù)觀(guān)測(cè)，也為單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)發(fā)展帶來(lái)了更多可能性。未來(lái)，團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步進(jìn)行深入研究，提高活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的可用性。